用于血流感染诊断的浓缩细菌DNA

发布时间:2017-10-02       作者:BMC infectious diseases       来源:临床实验室        浏览:7281       收藏: 0

———————— 摘    要 ————————


背 景:血液培养是用于鉴别败血症细菌性病原体的常见方法。诊断败血症的PCR试验需要从血液样品中提取细菌DNA,因此延误了进行合理抗生素治疗的时机。存在的多种人体DNA可能会严重降低PCR检测细菌的灵敏度。


方 法:我们通过连续稀释加入到假败血症血液样品中的大肠杆菌,开发了一种结合了极性清洁溶剂和基础pH调整的简单方法来去除人体DNA。建立一种基于基因的16S rRNA筛查算法来区分细菌菌群以及肠菌科的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,并对结果进行严格确认和合理控制。这种人体DNA去除方法随后通过实时PCR应用于194份败血症血样和44脑脊髓液(CSF)样品。


结 果:这个简单而直接的方法可以去除败血症患者外周血中98%的人体DNA。人体DNA的抑制效果非常明显,实时PCR的检测限可以提高到大肠杆菌10CFU/ml。灵敏度是传统的实时PCR试验的10倍以上。传统血液培养可以检测出58/194(30%)的败血症血样和9/44(21%)的CSF样品。在检测的194份样品中,传统的实时PCR仅能检测13种导致败血症的常见病原体细菌DNA,概率为16/194(8%)的血样以及14/44(32%)的CSF样品。我们的新方法能准确诊断78/194(40%)的血样和14(32%)份CSF样品。结合血液培养后,我们的技术能将败血症的诊断率提高到58%(112/194)。在检测的阳性组中,46份(24%)的病例与传统方法吻合。


结 论:我们报告的能从败血症血样中去除人体DNA的简单高效的室内方法是一种制备供后续PCR试验所用DNA的分析前工具。我们的室内DNA去除方法能提高检测率,后续PCR试验能达到大肠杆菌10CFU/ml的检测限,显著提高败血症的诊断率。


关键词:败血症、血流感染、人体DNA去除、分子诊断、血液培养



背    景


即使在开发出新的诊断和治疗技术后,败血症的病理生理学仍然难以完全阐明,发病率和死亡率还在逐步升高。诊断延误通常导致器官衰竭和致命的结局。血流感染(BSI)的准确和及时诊断能对在资源有限的环境中患者的护理和感染控制产生重要影响。尽管传统的血液培养已经作为金标方法推广使用,但是该方法仍存在多个短板。例如,血液培养极为耗时且仅能检测能在所用培养基中生长的细菌。每次需氧和厌氧菌培养至少需要30ml血液;这样的血量对于老年和新生儿患者是一种挑战。因此在传统血液培养方法的基础上,在临床环境中增加一种快速的诊断方法至关重要。


聚合酶链反应(PCR)为败血症患者细菌性病原体的快速诊断提供了新的可能性。此外,多引物形式的(多重)PCR可以在很短的时间内检测多种微生物病原体,尽管细菌性病原体的分子诊断具有很多优势,但是基于PCR的急性BSI诊断仍然很难。最关键的因素是PCR试验可能不能扩增存在于大量人体DNA中的少量病原体拷贝。此外,人血中的PCR抑制化合物能显著降低试验的灵敏度。例如,典型BSI病例的外周血细菌密度为1—1000CFU/ml。如果细菌载量超过1000CFU/ml,则最佳的PCR反应仅能扩增16S rRNA目标。因此,复制的血液培养结果中的PCR试验可能无效。菌株的多样性进一步使多重PCR反应的最佳条件复杂化。


评估期间2种原核基因组(例如古菌和变形菌)的融合形成了具有充足水平基因转移的真核基因组。这表明人体和细菌基因组间有可能存在同源和/或保守DNA序列,有可能导致引物错配,并进一步导致假阳性结果。商购分子诊断试验如SepsiTest(Molzym)和VYOO(SIRS Lab)在分子诊断前采用多种方法去除人体基因组DNA。这些分子试验中,采用DNAse裂解人体DNA或甲基层析柱的方法去除人体DNA。这些试验建议的人血用量较大。由于试剂盒比较昂贵,所以低收入国家通常难以负担这样的试验。


我们开发了一种结合极性清洁溶剂和基础pH调整的室内方法来去除人体DNA。利用基于实施PCR筛查算法的16rRNA来区分革兰氏阳性和阴性细菌以及肠杆菌科家族。而我们的新方法在194份败血症患者包含人体DNA的外周血样和44份包含少量人体DNA的CSF样品中得到了确认。我们比较了 i)传统血液培养方法(分支1);ii)利用从患者样品中提取DNA的传统实时PCR筛查(分支2);iii)利用去除了人体DNA的模板进行的实时PCR筛查(分支3)三个方法的诊断性能。


方    法


伦理学声明

该研究提交108家医院的机构审查委员会进行审查并获得了管理批准。在提交申请后,108家中心医院的伦理委员会同意并批准了该研究。参与研究的所有患者均签署了知情同意书,如参与者低于18周岁,知情同意书由父母或监护人签署。


连续稀释方法

在液体LB培养基中加入大肠杆菌DH5α菌株(新加坡英杰公司)进行增殖直到达到对数生长期。从10000CFU/ml到1CFU/ml连续稀释直到最后呈阴性,添加该细菌到5ml人血中。接着使用添加到人血中的细菌进行DNA去除程序并随后分离细菌DNA。取200μl 包含25mMTris-EDTA、100ng/μl 人体全血中提取的DNA、pH为8的溶液,在这样的溶液中重构从肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌和肠球菌单个菌落中分离的DNA,使用5ml上述溶液作为所有PCR或实时PCR的阳性质控品。


人体DNA的去除和细菌DNA的分离

筛检一些包含非离子(NP-40,Triton-X100)、离子(CTAB,SDS)和两性离子的清洗剂。只有Triton-X 100裂解哺乳动物细胞膜,但不会裂解大肠杆菌。因此Triton-X 100留作进一步分析。不同的条件如pH变化、时间变化和Na2CO2浓度的变化被优化。使用哺乳动物细胞裂解缓冲液MCLB-1混合包含1.2ml溶剂的1.2ml健康献血者血液来处理假败血症样品(添加100000大肠杆菌细胞)。溶剂处理后,离心悬浮液收集后续NaOH/SDS总DNA提取用的细菌小球。通过RT-PCR检查并定量人体DNA残存物和添加的大肠杆菌基因组。


经过一夜的培养后,将大肠杆菌添加到来自健康献血者的外周静脉血样品中建立稀释序列,稀释序列从1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml到0CFU/ml(阴性质控品)。稀释序列分为2组。第一组在室温下彻底与等量哺乳动物细胞裂解缓冲液(包含2M Na2CO2,pH9.8,1%Triton-X 100的MCLB-1)混合3分钟去除人体DNA,完全破碎的人体染色质混入DNA片段。培养步骤结束后,添加等量的中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH4.5)避免进一步细胞裂解。以5000g离心样品5分钟。去除上清液,在200μl 的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中复苏细菌小球,通过常规方法利用NaOH/SDS分离细菌DNA。


通过大肠杆菌特异引物/探针实时PCR或基于实时PCR,利用β球蛋白特异引物:betaF:5’-AGA AGA GCC AAG GAC AGG TAC G-3’,BetaR:5’-TGC TAG TGA ACA CAG TTG TGT CAG A-3’检测是否残余人体DNA和添加的大肠杆菌基因组DNA的完整性。


无菌条件下的试剂制备

25 mM Tris-HCl中备有100pmol/μl 所有引物和探针,使用1U DNase/20μL 反应量在37℃的环境中处理15分钟。随后,加热到95℃40分钟使DNAse丧失活性。丧失活性之后,储备物被分为10μl  的等份储存在-20℃的环境中。为了净化PCR主混合物,8-甲氧补骨脂素溶入二甲亚砜中。为了净化PCR液体和实时PCR主混合物试剂,溶入25μg /ml 8-甲氧补骨脂素并在3m外暴露于366nm紫外辐照10分钟。在小于5m的距离内以280nm的紫外辐照净化MCLB-1。每周喷洒DNA-ExitusPlus™溶液净化实验室的工作地点以及所有的附属设备和工具。


实时PCR的条件

实时PCR混合物有7.5μl  Taqman实时PCR主混合物、5μl  DNA模板、5pmol引物和0.2pmol探针组成。在Stratagene M3000p设备上通过在50℃的环境下培养15分钟、在95℃的环境下变性5分钟、接着运行95℃的45个循环15秒,60℃的循环60秒运行该反应。第一个实时PCR试验区分革兰氏阴性、革兰氏阳性和肠杆菌科。第二个试验利用引物和13个最常见病原体的特异Taqman探针区分明显的菌种,也就是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、肠球菌(革兰氏阳性菌)和埃希氏杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌(革兰氏阴性菌)。


败血症患者和采血

越南河内的108家军事中心医院共采集了败血症患者的194份外周静脉血样品和44份CSF样品。采样时间从2014年2月至2015年9月。内科医师基于高于35.3℃、低于36℃的体温、大于90次每分的心率、高于20次每分的呼吸频率、伴有下列至少一项症状和体征异常来假设或确认感染:排尿量显著下降、突然的意识变化、血小板计数下降、呼吸困难、心脏泵血功能异常或腹痛。患者的血样和CSF样品保存在肝素化试管中,分析前标本储存在4℃的环境中。


为了比较鉴别导致败血症病原体的诊断技术,所有患者一式两份采集了10ml静脉血或0.5mlCSF并分成等份留作需氧菌检测。血样进行自动化细菌培养,CSF用于传统细菌培养。同时,2.4ml血液或1ml CSF等分成一份样品(1.2ml血液或0.5mlCSF)用于直接总DNA提取,第二份样品(1.2ml血液或0.5ml CSF)用于细菌DNA提取之前去除人体DNA的MCLB-1处理。使用MCLB-1处理后从样品中分离的DNA用作筛查,区分革兰氏阴性、革兰氏阳性和肠杆菌。筛查步骤中出现的阳性样品将随后进行分组特异性实时PCR试验鉴别和确认上述13种引起败血症的常见病原体(图1a)。


自动细菌培养

每名患者采集20ml血液并等分注入10ml试管中,在BD BACTECTM 9120血液培养系统上以36±0.5℃的温度培养48小时直到试管中观测到细菌生长。培养24小时后,利用VITEK® 2自动化系统执行菌群鉴别。


传统细菌培养

为了开发用于CSF样品检测的诊断技术,我们利用了临床微生物学手册提供的方法和CDC实验室诊断脑膜炎的方法。简而言之,在600μl  PBS内漩涡振荡每个患者600μl 等份的CSF。生成的悬浮液置于4种培养基中,形成血琼脂、MacConkey琼脂、巧克力琼脂和缓冲的活性炭酵母浸液(BCYE),在有氧条件下、37℃的环境中培养3天。判定增殖并通过微生物学家确认。


结    果


人体DNA的去除效果

利用MCLB-1可以去除人体DNA,且不会影响细菌DNA(图2a)。我们的数据显示出添加的细菌呈高密度(>1000CFU/ml),人体DNA不会阻碍后续PCR。但是,在细菌量较低时(<100CFU/ml),人体DNA会抑制后续PCR反应(图2b,表1)。有效地防止人体DNA的抑制效果能将PCR的检测限升高到10CFU/ml,这是传统PCR试验无法达到的(图2,表1)。区分革兰氏阴性、革兰氏阳性和肠杆菌科仅需4小时,还需要额外2小时进行实时PCR试验鉴别菌种(图1b)。


检测限

为了确定实时PCR能够检测细菌DNA时添加的大肠杆菌的浓度以及PCR不能区分添加的细菌DNA和污染前微生物DNA的临界值浓度,我们培养大肠杆菌并将其添加到健康献血者的血样中建立1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml和0CFU/ml(阴性质控品)的稀释序列。将其等分成若干等份,允许对基于MCLB-1的人体DNA去除和DNA提取进行独立的技术辅助。细菌DNA用作利用引物、肠杆菌和大肠杆菌特异探针的实时PCR的模板。实时PCR能在浓度为100-1000CFU/ml时检测添加的大肠杆菌,1000CFU/ml时的Ct值为29.2±0.5,100CFU/ml时的Ct值为34.5±0.5(表2)。此外,实时PCR仍能检出7/20个样品中的大肠杆菌,在浓度为1CFU/ml时,Ct值为4.2±1.3。这些结果表明在浓度为1CFU/ml时我们的实时PCR程序不能区分添加的细菌和先前污染的细菌DNA。因此出于实践的目的,我们设置临界值为10CFU/ml,与研究中所有病原体37的Ct值一致。


血液培养鉴别病原体和分子诊断鉴别病原体的比较

在194份败血症患者的血液和44份败血症患者的CSF样品中,我们确认了PCR诊断前使用MCLB-1处理去除人体DNA的优势。样品分为3个分支,分支1进行血液培养、分支2进行直接NaOH/SDS DNA提取和传统的RT-PCR分析,分支3使用MCLB-1处理并随后进行RT-PCR检测。在44份CSF样品中,人体DNA的存在量很低,传统PCR和使用MCLB-1处理之后进行的PCR试验的结果相一致(14/44阳性案例)。PCR的检测率高于血液培养,血液培养仅仅检出了9/44份CSF样品(图3)。但是在194份样品中,所有传统PCR鉴别阳性的样品得到了经MCLB-1处理的实时PCR的确认(图4)。不仅如此,传统方法仅能检出16/194份样品,表明其检测率低于经MCLB-1处理的PCR方法。这些结果明确显示有效去除败血症患者血样中人体DNA的方法优势明显,有益于PCR诊断。


在194份败血症患者的血样中,血液培养(分支1)检出58(30%)份阳性样品,其中15份(8%)为其他菌种,也就是阪崎肠杆菌(1例)、产单核细胞(2例)、粪产碱杆菌(1例)、荧光假单胞菌(3例)、嗜麦芽寡养单胞菌(1例)、白色念珠菌(1例)、产气肠杆菌(1例)、摩根氏菌(2例)、类鼻疽伯克氏菌(1例)、热带假丝酵母菌(1例)和洋葱伯克霍尔德菌(1例)(图4a)。利用MCLB-1处理的室内实时PCR方法(分支3)检出了78/194(40%)的BSI样品。结合血液培养和基于MCLB-1的实时PCR方法能将灵敏度升高到58%(112个阳性案例)。我们观察到血液培养和基于MCLB-1的实时PCR鉴别出46/112个阳性案例(41%的阳性案例,或24%的总血样),在这46个案例中,24(21%的阳性案例或12%的总血样)个案例的鉴别水平为菌种级别(图4a、b)。


讨    论


我们的稀释序列可以有效抑制人体DNA的对后续检测细菌的PCR试验的干扰作用。一旦有效地去除了静脉血样中的人体DNA,实时PCR的检测限将加强10倍以上。尽管去除人体DNA不能改进包含少量人体DNA的样品如CSF样品的PCR检测,但是能显著提高包含丰富人体DNA的血样的诊断成功率。


无论对于发达国家还是卫生资源有限的国家,菌血症的死亡风险都很高。我们的种属特异性实时PCR试验结合室内人体DNA去除方法不仅能进行快速诊断还能提高病原体检测的灵敏度和特异性。


血液培养被视为细菌或真菌BSI诊断的金标准。该方法只能在24—48小时或在更长的时间后提供结果,先基于假设的某种细菌鉴别采取相应的治疗措施,这种方法至少耗时24—48小时,采取的治疗也可能会严重失误。BSI早期诊断和适当治疗的最佳时机是最初的6—12小时内。开发BSI快速诊断对传统的血液培养方法进行补充刻不容缓。基于核酸的诊断方法已经在应对这种需求。但是血液内病原体DNA的含量低且存在PCR抑制化合物如人体DNA仍是挑战。


结合温和的清洗剂(包含2M Na2CO2,1%Triton-X 100,pH为9.8的MCLB-1)处理3分钟就能去除全血中98%的人体DNA。分子检测前仅需要很短的时间就能进行细菌DNA处理,且不会明显损伤细菌DNA。此外,由于存在温和的清洗剂,人血细胞被有效破坏,释放人体DNA,但不会影响细菌和真菌细胞。升高到9.8的pH值(碳酸钠)确保成功降解人体DNA,完整地浓缩了血液中的细菌和真菌。但是选择性的裂解反应时间需要得到有效控制,否则暴露时间过长会裂解细菌的细胞壁。


现有的商购DNA去除试剂盒如MolYsis Basic和Looxster适合高血量样品,需要甲基化的层析柱或DNAse专利。由于费用显著偏高,所以低收入国家通常难以承担这笔费用。


败血症的治疗通常取决于基于革兰氏染色和/或菌群特异性的假设细菌鉴别。我们的程序是一个系统性方法,由实时PCR反应逐步开展鉴别革兰氏阴性、革兰氏阳性和肠杆菌。如果患者样品呈现某种病原体阳性,菌株特异性Taqman实时PCR将指明是哪种病原体。我们的方法在4小时内就可以完成诊断,不仅能快速地获得结果,还能显著降低大量病原体独立PCR反应的成本。


我们的研究建议临床实践将临界值设置为10CFU/ml。这一检测限排除了细菌载量低于10CFU/ml的患者的阳性结果。这部分解释了我们的分子方法不能包括所有血液培养的阳性案例的原因。另外,对于已经采取抗生素治疗的患者而言,血液培养经常导致不可靠的诊断。这也部分解释了我们的方法与血液培养方法结果有时不一致的原因。我们的结果和其他研究结果显示我们的方法与血液培养方法之间存在的差异性介于8%—80%之间,取决于使用的材料。这就解释了不建议临床采用Septifast试剂盒诊断疑似败血症的原因。尽管我们的方法与血液培养方法间的重合率为23.7%,但是结合这两种方法可以将诊断灵敏度提高到57.7%。即使是单独使用我们的方法,34%的阳性率也显著高于血液培养的8%。此外,我们的方法仅需4小时,检测时间比现在市场上所有的商购试剂盒都要短至少18小时。


我们的检测方法不能改进含有低水平人体DNA样品的诊断,例如CSF标本。治疗前为后续PCR和/或实时PCR提供一个改进的DNA模板能达到10CFU/ml的灵敏度。


结    论


我们开发了一种简单有效的败血症血样人体DNA去除方法。该方法能为后续的细菌DNA PCR检测提供浓缩的细菌DNA。采用我们的方法后,后续的PCR试验能达到10CFU/ml的检测限,因此提高了败血症诊断的阳性率。




图1. 人体DNA去除方法的工作流程

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A:比较PCR和血液培养诊断引起败血症的病原体的研究流程图;

B:以细菌16SrRNA为目标的PCR反应分组特异性筛查区分革兰氏阳性、革兰氏阴性和肠杆菌。筛查试验的阳性样品提交种属特异性实时PCR反应检测13种最常见的败血症致病病原体。


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图2. 人体DNA去除的效果和PCR试验的灵敏度

A:通过扩增试验衍生的β球蛋白监测MCLB-1处理后残余的人体DNA。上一片凝胶基于以β球蛋白基因为目标的PCR试验;下一片是基于实时PCR的荧光染料定量残余β球蛋白基因片段。

B:在多个密度添加的大肠杆菌的检测限。添加的细菌密度较高时(1000CFU/ml或10000CFU/ml),去除人体DNA不能提供显著的诊断信号,但是在低密度时(100CFU/ml或10CFU/ml),去除人体DNA将PCR诊断检测限提高到10CFU/ml。

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图3. CSF样品中败血症致病病原体诊断方法的比较

A:文氏图显示血液培养方法(深灰色-分支1)、使用传统NaOH DNA提取方法的实时PCR(浅灰色-分支2)和使用DNA去除法的PCR(浅灰色-分支3)的诊断重叠;

B:诊断性能:传统血液培养(灰色条)、使用总人体DNA的传统实时PCR(黑色条)和使用MCLB-1处理样品去除人体DNA的实时PCR算法。

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图4. 人体败血症样品内败血症致病病原体诊断方法的比较

A:文氏图显示:使用去除人类DNA的输入样品的PCR-分支3和血液培养方法-分支1的重叠;

B:详细诊断性能:传统血液培养方法(灰色条)或使用从总人血败血症样品中提取的DNA的传统实时PCR(黑色条)或使用MCLB-1处理的样品的算法的实时PCR。

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摘自《BMC infectious diseases》,版权归其所有,仅供内部参考

编译:张凯

审校:韩泯、方研


本文链接:http://www.ddm360.com/article/detail/533
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