基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪 鉴定阳性培养瓶细菌的新进展

发布时间:2017-10-02       作者:曲芬       来源:临床实验室        浏览:14567       收藏: 1

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曲芬,解放军第三〇二医院临床检验医学中心主任医师,教授,北京大学医学部、解放军医学院及河北北方学院的硕士研究生导师,公派法国地中海大学访问学者。现任解放军第十届医学科学技术委员会检验医学委员;中国药学会抗生素专业委员会委员;中国研究型医院学会检验医学专业委员会委员;全国卫生产业企业管理协会实验医学专家委员会委员;中国医师协会检验分会精准检测和诊断专业委员会委员;华人药敏委员会(ChiCAST)学术顾问;中国合格评定中心医学实验室主任评审员。

主要研究领域是临床微生物的诊断、耐药监测及耐药机制研究。进行新药的体外抗菌活性研究、质谱新技术的临床应用前评估多项。独立承担全军“十二五”重点课题等8项课题;以第一或通讯作者在国内外期刊发表论文200余篇,主编、副主编专著4部。获军队科技成果一等奖1项,军队医疗成果奖二等奖4项,三等奖5项;中华预防医学会科学技术成果二等奖1项。


摘  要:目前质谱仪用于鉴定临床微生物较普遍,并体现了鉴定范围广、鉴定速度快、灵敏度高、成本低的优越性。而针对临床败血症病例的发病率和死亡率高的严重性,迫切需要不断优化流程进而提高诊断速度,为严重败血症的早期救治提供支持。近年来,不断探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)快速鉴定阳性培养瓶细菌的效果,以期进一步缩短报告时间。本文对其研究新进展做一综述。


关键词:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪,鉴定,培养瓶,进展



基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是近几年快速发展起来的应用于细菌全细胞快速检测的一项技术,并在全球迅速发展和应用。目前中国上市的包括毅新博创的Clin-ToF质谱仪、布鲁克(Bruker)的Mixcroflex及生物梅里埃(BioMérieux)公司的VITEK MS质谱仪。自2000年首先应用于临床以来,已广泛用于鉴定临床微生物包括细菌及真菌的鉴定。与传统微生物鉴定技术比较,MALDI-TOF-MS体现了鉴定范围广、鉴定速度快、灵敏度高、成本低的优越性。近年来,临床血流感染的败血症病例的发生率和死亡率持续升高,在美国每年因败血症死亡的病例达23-37万例【1】,而中国重症医学科患者败血症的发生率达37.3%,死亡率高达33.5%-48.7%【2-3】。研究显示重症败血症的生存率与开始正确抗生素治疗的时间呈直接负相关,即随着开始治疗时间的延后,生存率直线下降,半小时以内用药的生存率达80%以上,而36小时以后用药生存率不到5%【4】。迫切需要不断优化流程而提高诊断速度,为严重败血症的早期救治提供支持。


阳性血培养样本的直接MALDI-TOF-MS检测与培养纯菌落的检测至少节省18-24小时,而处理阳性血培养液的核心是需要去除细胞和杂质蛋白,富集足量细菌方可实现MALDI-TOF-MS的检测。其过程影响因素多,菌体蛋白样本制备过程中如果混杂培养基的成分,会导致离子抑制,降低检测灵敏度,样本谱图采集困难、信号噪音大、峰数目少,难于鉴定【5-6】;洗涤菌体是降低培养基成分影响的有效途径。不同的处理成分如溶血剂、裂解液、洗涤的彻底程度、离心的速度与时间甚至Cut-off值的设定都影响鉴定的评价效果。 


Lin JF等首先证实阳性血培养的标本的原液、低速离心(66g)均无质谱信号,而高速离心(3000g)有微弱信号,经裂解后进行MALDI-TOF-MS检测高速离心(3000g)有清晰的质谱信号,并与纯菌落的信号峰一致,但峰值明显减低,说明鉴定结果正确但分值低,提示进行阳性血培养瓶处理后鉴定可适当降低cut-off值。在此基础上建立经济快速的两步三离心法,即首先培养液离心600g10秒,上清液再离心3000g60秒为第一步,加入Buffer1.5ml,3分钟后离心3000g60秒,挑取白色的薄膜点样质谱检测,整个过程10分钟内,费用不足0.2美元,鉴定准确率达81.8%,鉴定时间比传种培养减少18小时【7】。


比较简单低成本的培养液前处理方法有直接过滤法和分离胶促凝法。Fothergill A等用直接过滤法处理阳性培养瓶的培养液,共研究259份标本,首先取2ml培养液在室温下用裂解缓冲液孵育2~4分钟,再用过滤膜(直径0.2μm)过滤溶解液40秒,然后Buffer和水洗涤各3次,拭子取出富集细菌点靶并加基质用VMS鉴定。结果正确鉴定到种水平73%,到属水平75.3%;不同类别病原菌的正确鉴定率分别为革兰阳性菌74.5%,革兰阴性菌84%,酵母菌94.1%。该方法优点是不需要离心,整个过程15分钟内完成【8】。国内的陈峰等用分离胶促凝管处理血培养瓶的质谱鉴定,方法是无菌注射器抽取2ml血培养瓶内容物转移至INSEPACK® ST740CG型真空采血管内,室温下1209g离心10分钟,血细胞和有形杂质被离心至分离胶的下层,弃去上清液后在分离胶边缘的灰白色沉淀为菌体富集物,牙签挑取点靶,经乙醇/甲酸提取法质谱检测。在462株单菌的种和属水平的正确鉴定率在革兰阳性菌分别为75.3%和89.6%,革兰阴性菌分别为84%和86.9%,29株复数菌检测出一种菌的种和属水平的正确率分别为79.3%和89.6%。是一种快速、简便、成本低、易推广的方法【9】。


实际应用更多的是裂解法,包括皂甙裂解及SDS裂解法。前者即阳性培养液加500ml4%的皂甙裂解液旋转混匀10秒,离心13000g1分钟,弃去上清液,加1ml去离子水,旋转混匀10秒,离心13000g1分钟,弃去上清液,进行加样前处理、质谱检测。菌属水平的鉴定正确率76.4%,明显高于直接离心法的68.7%(P=0.003)。另有报道同样的处理方法鉴定细菌在种和属水平的正确率在单菌培养液为72.1%和89.6%;在复菌培养液为82.5%和92.5%。在不同的Cut-off值的正确率分别为大于等于1.5时75.8%、1.7时61.5%和2.0时为35.1%。而SDS处理方法是1ml阳性培养液加100μL的20%SDS溶液,旋转混匀10秒,16000RCF2分钟,弃掉上清液,用1ml的去离子水洗涤,再16000RCF2分钟离心,取菌苔乙醇/甲酸处理,质谱检测。鉴定正确率达到90%,究竟培养液的直接检测Cut-off值设定多少特异性最好,有待于进一步研究【10-11】。进一步比较不同裂解液种水平鉴定正确率,结果显示SDS裂解液高于皂甙裂解液,与SepsiTyper试剂盒的效果相同,但费用明显减少;在Cut-off值为1.7和2.0的的正确率提高10%-30%【10,12-14】。


德国的奥尔登堡大学医院卫生研究所把阳性培养瓶快速孵育后质谱检测并报告给临床作为常规程序。即阳性培养瓶转种2-3小时的生长菌苔质谱鉴定,不生长则继续培养2-3小时再上质谱,结果显示革兰阴性菌平均2.5小时、革兰阳性菌平均3.8小时可报结果,比常规检测的报告时间15小时明显提速。作者进一步评估对临床的指导作用,快速孵育的质谱鉴定可直接指导临床72.2%的患者更改治疗方案,真正改善临床效果【15】。


对临床最有快速直接指导作用的是药敏实验结果。Jette S. Jung等报道了质谱半定量阳性瓶细菌的敏感性。方法是选取30株细菌注入血培养瓶和90个病人的阳性血培养瓶,约6h培养仪报警,涂片为革兰阴性菌的做质谱鉴定,同时进行药敏。1ml阳性血培养液注入8.5ml的血清分离胶试管,4300g、5min离心,弃去血清,胶表面的颗粒小心用1ml纯净水再悬浮,转移到EP管,制成5×106的菌悬液,取各200μl加抗生素与不加抗生素,抗生素的稀释浓度高于敏感折点,庆大霉素4mg/L、头孢噻肟2mg/L、环丙沙星1mg/L、哌拉西林钠/他唑巴坦16/4mg/L,30株注入培养瓶测定庆大霉素和环丙沙星,90个病人孵育2.5-3h,纯水洗涤,甲酸提取,MALDI测定,约4小时内完成细菌鉴定和药敏预测。结果共分离到129株革兰阴性菌,与标准的MIC耐药及敏感判断正确率分别为庆大霉素100%、头孢噻肟100%、哌拉西林钠/他唑巴坦94.95%和环丙沙星99.22%,快速且与药敏标准判断的一致性较好【16】。同样的用8μg/ml浓度的美罗培南孵育1小时检测肺炎克雷伯菌对美罗培南的耐药性,敏感性和特异性分别达到97.3%和93.5%【17】。也有同时评估革兰阴性菌与革兰阳性菌的多种抗生素的药敏结果,一致率达到91.11%,小错误率6.69%,大错误率2.72%,很严重错误率1.45%,体现了对临床抗感染治疗的重要指导作用【18】。


MALDI-TOF在临床微生物快速诊断方面的优越性在不断提高,其开发潜力也在不断被挖掘,成为提高临床救治成功率的有力工具。不同的研究方法、不同的前处理鉴定效果及作用不同,需要我们在实际工作中不断积累、不断总结、不断完善。


参考文献:

1、Gaieski DF,Edwards JM,Kallan MJ,Carr BG. Benchmarking 

the incidence and mortality of severe sepsis in the United States. Crit Care Med 2013;41:1167-74.

2、Zhou J,Qian C,Zhao M,et al. Epidemiology and outcome 

of severe sepsis and septic shock in intensive care units in mainland China. PLoS One 2014;9:e107181.

3、Singer M,Deutschman CS,Seymour CW,et al. The Third 

International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 2016;315:801-10.

4、Kumar A,Roberts D,Wood KE,et al. : Duration of 

hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med,34: 1589-1596,2006.

5、Xiao D,Zhao F,Lv M,et al. Rapid identification of 

microorganisms isolated from throat swab specimens of community-acquired pneumonia patients by two MALDI-TOF MS systems [J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(4): 301-307.

6、Buskirk AD,Hettick JM,Chipinda,et al. Fungal pigments 

inhibit the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of darkly pigmented fungi [J]. Anal Biochem,2011,411:122-128.

7、Lin JF,Ge MC,Liu TP,et al. A simple method for rapid 

microbial identification from positive monomicrobial blood culture bottles through matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J Microbiol Immunol Infect. 2017,30. pii: S1684-1182(17)30101-9. 

8、Fothergill A,Kasinathan V,Hyman J,et al. Rapid 

identification of bacteria and yeasts from positive-blood-culture bottles by using a lysis-filtration method and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum analysis with the SARAMIS database. J Clin Microbiol. 2013;51(3):805-9. 

9、陈峰,李媛睿,皇甫昱婵等,分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS

直接检测血培养阳性细菌,检验医学,2015;30(2),113-121.

10、Shota Yonetani,Hiroaki Ohnishi,Kiyofumi Ohkusu,et al. 

Direct identification of microorganisms from positive blood cultures by MALDI-TOF MS using an in-house saponin method. International Journal of Infectious Diseases,52(2016);37-42.


11、Chien JY,et al. Front Microbiol. 2016 Sep 15;7:1432.

12、Hannah Tanner,Jason T. Evans,Savita Gossain,Abid 

Hussain. Evaluation of three sample preparation methods for the direct identification of bacteria in positive blood cultures by MALDI-TOF.BMC Res Notes. 2017;10: 48. Published online 2017 Jan 18. 

13、D. Martiny & A. Dediste & O. Vandenberg Comparison of 

an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser. Eur J Clin Microbiol Infect Dis(2012)31:2269-2281.

14、C. Yvan,G. Cécile,R Mariya et al. Superiority of SDS 

lysis over saponin lysis for direct bacterial identification from positive blood culture bottle by MALDI-TOF MS. www.clinical.proteomics-journal.com

15、Robin Köck,Jörg Wüllenweber,Dagmar Horn,et al. 

Implementation of short incubation MALDI-TOF MS identification from positive blood cultures in routine diagnostics and effects on empiric antimicrobial therapy.Antimicrob Resist Infect Control. 2017;6: 12. Published online 2017 Jan 14.

16、Jette S. Jung, Christina Hamacher,Birgit Gross,et al.  

Evaluation of a Semiquantitative Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Method for Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing of Positive Blood Cultures.J Clin Microbiol. 2016 Nov;54(11): 2820-2824. 

17、Christoph Lange,Sören Schubert,Jette Jung,et al. 

Quantitative Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Rapid Resistance Detection. J Clin Microbiol. 2014 Dec;52(12): 4155-4162.

18、Jungil Choi,Hyun Yong Jeong,Gi Yoon Lee,et al. 

Direct,rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Sci Rep. 2017;7: 1148. Published online 2017 Apr 25.


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